IDENTIFICANDO MICOBACTÉRIAS

Pesquisando Causadores Da Turberculose

A mycobacterium ssp é o principal agente causador da tuberculose humana, e para fins diagnóstico é preciso usar ume metodologia fora do convencional para identificá-lo na rotina laboratorial. Vamos entender algumas características da sua classe: são bacilos ligeiramente curvos ou retos que raramente se ramificam, possuem crescimento lento e são imóveis (não esporulados).  Essas bactérias são encontrados no solo, na água e até em aerossóis. Também é importante saber que são álcool-ácido resistentes, resistindo à descoloração com álcool acidificado. São aeróbio obrigatório e agente de infecções crônicas, granulomatosas Intracelulares. Conseguem se multiplicar dentro de macrófagos.

A IMPORTÂNCAI DA SUA ESTRUTURA

As mycobacterium ssp sintetizam ácidos micólicos que constituem o suporte molecular de álcool-ácido resistente e a análise da sua composição é um elemento essencial para caracterização das espécies de miobactérias.

Nem todas micobactérias são tuberculosas, na verdade, são classificadas justamente em tuberculosas e não tuberculosas, sendo a mais recorrente no seres humanos a mycobacterium ssp. Vamos ver a estrutura que devemos identificar para constatação de mycobacterium:

PATOGENESE E MECANISMOS

As mycobacterium causadores de tuberculosas entram na classe do Complexo M. tuberculosis; M. bovis e M. africans. Seu grau de virulência depende dos lipídios, em um evento chamado de ''fator corda'': os bacilos compactados formam uma corda de navio, quanto mais desse fator corda estiver presente mais virulento ele é.

Através da inoculação o Mycobacterium se instala no parênquima pulmonar, forma um nódulo conhecido como nódulo de Ghon . Nódulo de Ghon + Nódulos nos linfonodos = complexo primário da tuberculose.

SOBRE A AMOSTRA

A amostra deve ser um escarro expectorado e analisado em até 12h em temepratura ambiente ou em 48h refrigerado. Também pode ser um lavado broncoalveolar, urina (todo volume da primeira urina da manhã), liquor, e outras secreções.

ABORDAGEM LABORATORIAL

Trabalhar em cabine de segurança biológica, ou em laboratórios onde só se faz baciloscopia. Adicionar hipoclorito 2% para o tratamento das amostras. Então, será feito a baciloscopia e cultura.

Em virtude da alta concentração de lipídios nas suas paredes celulares, a maioria das micobactérias é mais resistente a ação de soluções ácidas e alcalinas fortes do que outras bactérias presentes na amostra.

As amostras são tratadas com agentes descontaminantes para reduzir a concentração de bactérias indesejáveis e liquefazer o muco. Após determinado tempo, o álcali ou ácido é neutralizado e a mistura centrifugada para concentração das bactérias. Métodos mais indicados: método de Nalc NaOH ( N acetil L cisteína com hidróxido de sódio) é o mais usado. Entretanto também pode ser realizado pelos métodos de Petroff e modificado escarro e ácido oxálico Fibrose cística.

COLORAÇÃO DE BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTENTES

Em virtude de seu elevado conteúdo de lipídeos, as paredes celulares das micobactérias tem a capacidade de fixar o corante fucsina, que não pode ser removido pelo álcool ácido São utilizados dois tipos de coloração álcool ácido resistentes: 

Coloração com carbolfucsina mistura de fucsina com fenol (ácido carbólico), conhecido nos laboratórios como coloração de Ziehl Neelsen. 

E, também, coloração com fluorcromo : auramina.

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN

1- Cobrir o esfregaço seco e fixado com calor com um pequeno retângulo de papel filtro;
2- Aplicar 5 a 7 gotas do corante carbolfucsina até umedecer totalmente o papel de filtro;
3- Aquecer a lâmina coberta pelo corante até emissão de vapor, mas sem deixar secar;
4- Retirar o papel com pinça, lavar a lâmina com água e escorrer;
5- Descorar com álcool ácido até que não apareça mais o corante no lavado;
6- Contracorar com azul de metileno durante 1 a 2 minutos;
7- Enxaguar, escorrer e secar ao ar e examinar em óleo de imersão;
8- As bactérias coram se de vermelho e o fundo aparece azul;

A propriedade álcool resistente deve se à cápsula cerosa espessa que circunda as células micobacterianas . Para que a carbolfucsina penetre através da cera, a cápsula precisa ser amaciada. Por isso, o corante penetra través da cápsula amolecida pelo calor, liga se à parede celular. Quando as bactérias esfriam, a cera novamente endurece, protegendo o corante contra a ação do descorante álcool ácido.

COLORAÇÃO COM AURAMINA

1- Cobrir o esfregaço seco e fixado com calor com carbol auramina e deixar corar 15 min;
2- A auramina liga se ao ácido micólico;
3- Não aquecer e não cobrir com papel filtro;
4- Lavar com água e escorrer;
5- Descorar com álcool ácido por 2 min;
6- Enxaguar com água e escorrer;
7- Cobrir o esfregaço com permanganato de potássio por pelo menos 2 min.
8- descorante álcool ácido;
9- Lavar com água corrente e escorrer;
10- Examinar com objetiva de 25x utilizando uma lâmpada de vapor de mercúrio e um filtro BG 12 ou uma luz azul intensa;
11- As bactérias coram se de laranja amarelado contra um fundo escuro;

INTERPRETANDO RESULTADOS

Critério para leitura e interepretação dos resultados da Baciloscopia de Escarro corada pelo método de Ziehl-Neelsen:

REFERÊNCIA:

- BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. 
-TSUKAMURA, M. Identification of mycobacteria. Mycobacteriosis Resear
- FELDMAN, W.H. Non-leprous and Non-tuberculous Mycobacterial Infections. In: COCHRANE