Iniciadores Chamados Primers

Funções e Importância Dos Primers Na Biomol

Primers são chamados de iniciadores, pois nada mais são do que uma sequência curta de RNA em meio ao DNA de geralmente 18 a 22 bases nitrogenadas, que serve como ponto de partida para síntese de DNA. Essa sequência, via de regra, é obrigatória para começar o processo de replicação do DNA.

Assim dizemos que o reconhecimento do primer é o primeiro passo para que possamos replicar nossos genes. 

As enzimas que catalisam o processo de replicação (DNA polimerase), só podem adicionar novos nucleotídeos a uma cadeia de primer existente. Diversas técnicas de laboratórios comerciais e/ou de pesquisas in vitro usam primers de DNA como iniciadores de reações como sequenciamento do DNA humano e reação em cadeia da polimerase - PCR.

PRIMASE ou PRIMER? ENTENDA!

Para que a polimerase III do DNA comece uma polimerização é necessário que uma outra enzima adicione os primeiros nucleotídeos. Essa enzima é uma polimerase especial que catalisa a síntese de um pequeno fragmento de RNA sobre a cadeia molde do DNA, o qual atua como iniciador para a polimerase III do DNA adicionar desoxirribonucleotídeos. O fragmento de RNA iniciador de uma cadeia de DNA, que em bactéria tem cerca de 5 a 10 nucleotídeos, é chamado de primer de RNA e a enzima que catalisa sua síntese é denominada primase do DNA.

OS PRIMERS NA TÉCNICA DE PCR

Além de dar especificidade (determina a parte do gene a ser amplificada).

Os primers usados nos laboratórios são comprados, alguns são desenhados na mão pelo profissional e encomendados e entregue pelo fornecedor que fará a entrega em seu laboratório.

Para fazer sua PCR, é preciso conhecer a sequência do seu fragmento alvo, ou pelo menos as extremidades desse fragmento. Como consigo essa informação? Simples, através da literatura ou em algum banco de dados procurando a sequência do alvo em que você deseja amplificar. Sabendo disso, o profissional usa alguns softwears (Primer-BLAST & Primer3 Plus, por exemplo) que auxiliam no desenho dos primers que vão se ligar de maneira complementar e específica no seu alvo.

É muito comum a compra de primers PRONTOS também, por exemplo, se o alvo analisado é muito conhecido e explorado (laboratórios clínicos de diagnóstico em testes de DNA).

CRITÉRIOS BÁSICOS

Alguns critérios que devemos levar em consideração em relação ao primers é o de que, primeiramente, devem ser específicos ao alvo. Todos os primers vem em pares, que são as sequências complementares das extremidades do seu alvo, chamamos um deles de PRIMER FORWARD e o outro de PRIMER REVERSE:

O par de primers Forward e Reverse devem ter temperatura de anelamento muito parecida. Sua importância na PCR está no fato de que, embora os protocolos apontem que a temperatura de anelamento seja 60°C, o que realmente determina essa temperatura é o primer. Alguns primers demandam maior temperatura de anelamento (62°, 63°, 64°), e alguns demandam uma temperatura mais baixa (55°, 56°). 

Outro fator que deve ser considerado é a quantidade de bases nitrogenadas, quanto maior for o tamanho do primer, maior a temperatura de anelamento exigida para o bom funcionamento da PCR. 

Não menos importante, a quantidade de citocina e guanina em relação a timina e adenina também influenciam na temperatura de anelamento porque essas duas bases nitrogenadas fazem ligações triplas, enquanto que timina e adenina fazem apenas ligações duplas. 

POSSIBILDIADES DE DIMERIZAÇÃO NA PCR

Um primer é um DNA fita simples, isso significa que se ele estiver em uma solução em condições ideais, este primer poderá se ligar a outro primer, como por exemplo, um primer forward se ligar a um primer reverse, ou até um primer reverse se ligar a outro primer reverse. 

Existe até a possibilidade de um primer se ligar nele mesmo, formando o que chamamos de hairpin. Quando essas situações ocorrem, temos uma diminuição na eficiência da nossa reação em PCR. Portanto, é preciso saber o grau de dimerização do seus primers.

REFERÊNCIA:

- A Replicação Do DNA - Apostila - Biologia Molecular USP;
- Biologia Molecular da Célula: Alberts Johnson Lewis 6°edição;