Reação Em Cadeia Da Polimerase

Fundamentos Da PCR

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi inventada pelo americano Kary Mullis que recebeu o prêmio Nobel de química em 1993. Mas o que é PCR? É uma técnica laboratorial que permite fazer milhões e até bilhões de cópias de uma região específica do DNA, escolhida de acordo com o interesse do profissional e necessidade do caso que estiver em questão. Por exemplo, é comumente usados pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.

A PCR veio para resolver dois grandes problemas: obter material genético em grande quantidade e especificidade. Graças a PCR podemos fazer milhões e bilhões de cópias de um único gene em especial do seu interesse, sendo extremamente útil para diagnósticos, acompanhamentos clínicos, pesquisas científicas e muito mais. O material obtido pela técnica de PCR é geralmente encaminhado para uma segunda técnica, tal como o sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para experimentos em pesquisa.

OS INGREDIENTES PARA FAZER UMA PCR

A PCR requer alguns ingredientes indispensáveis, vamos comentar sobre esses ingredientes, como funcionam e o porquê da sua necessidade, são eles: Taq polimerase, primers e dNTPs.

Taq polimerase: da mesma maneira como a replicação de DNA em uma célula, a PCR precisa de uma enzima DNA polimerase que faça as novas fitam de DNA usando as existentes como moldes. Porém, na nossa PCR, usamos a chamada Taq polimerase, que é um tipo de DNA polimerase que resiste a temperaturas mais altas, seu nome foi dado em homenagem à bactéria que resiste ao calor (Thermus aquaticus). A DNA polimerase dessa bactéria consegue ser estável ao calor e atinge alta atividade à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de outras bactérias seriam disfuncionais), essa estabilidade que torna a Taq polimerase ideal para PCRs, pois veremos mais à frente que altas temperaturas são usadas repetidamente.

Primers: os primers são fragmentos de DNA de fita simples, o ponto de partida, uma sequência curta de nucleotídeos que possibilita o reconhecimento da Taq polimerase. Essa sequência é o que vai dar especificidade para a região do gene a ser amplificada. Os primers são ''desenhados'' pelo profissional ou pesquisador, geralmente usam algum banco de dados para descobrir a sequência inicial (5') e final (3') do seu gene de interesse. Assim, a Taq polimerase vai se ligar apenas nesses dois primers, formando uma dupla fita apenas da região que você deseja. 

dNTPs: são chamados de desoxirribonucleotídeos fosfatados, basicamente, são iguais os nucleotídeos que conhecemos, possuem um açúcar, uma base nitrogenada, porém, a grande diferença é que ao invés de um único fosfato, possuem três fosfatos, por isso do nome ''fosfatado''. 

COMO FUNCIONA UM PCR?

Agora que sabemos que os ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers e dNTPs (além do DNA molde extraído), serão todos reunidos em um tubo, adicionando alguns cofatores que a enzima precisa, geralmente esse cofator é o cloreto de magnésio. Esse reagente, cloreto de magnésio, pode influenciar drasticamente o funcionamento de uma reação de PCR, podendo afetar as temperaturas de desnaturação das fitas de DNA e o anelamento dos primers.

A PCR ocorre em um aparelho chamado de termociclador, responsável por alterar a temperatura dos tubos que foram colocados ali no tempo que determinado pelo profissional, as temperaturas também podem ser reguladas. A idéia da mudança de temperatura entre temperaturas altas e baixas em tempos pré-determinados é o que possibilita a transação nos estágios de desnaturação, anelamento e extensão. Vamos comentar cada um deles:

ETAPAS DA PCR 

Desnaturação (96°C): aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso gera uma fita simples para a próxima etapa.

Anelamento (55 a 65°C): resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.

Extensão (72°C): eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Cada vez que a sua amostra passa pela sequência das etapas de desnaturação, anelamento e finalmente a extensão, dizemos que encerrou um ciclo. Estes ciclos se repetem por até 35 vezes em uma PCR comum, em aproximadamente 2 a 4 horas (depende do comprimento da região de DNA a ser copiada). Se a reação funcionar, teremos até bilhões de cópias. Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo, de maneira exponencial.

Fonte da figura: Khan Academy - Reação em Cadeia da Polimerase (https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr)

REFERÊNCIA:

- Biologia Molecular da Célula: Alberts Johnson Lewis 6°edição;

- MOLINA, A.L.; TOBO, P. R. Série Biologia Molecular Parte 2- Uso das Técnicas de biologia        molecular para diagnóstico.Hospital IsraelitaAlbert Einstein. São Paulo-SP.2004.