Testes de E.L.I.S.A

Antígeno-Anticorpo Detectáveis por Enzimas

ELISA DIRETO

As placas para o ELISA contêm 96 poços, mas você pode usar apenas a quantidade de poços que precisa. No caso do ELISA DIRETO, estes poços já vêm com anticorpos específicos pro seu antígeno de interesse, do qual você quer identificar. Adicionamos nestes poços a amostra do paciente. Se o paciente tiver os antígenos pra doença em questão, eles irão se ligar aos anticorpos presentes naquela placa. Após adicionar a amostra do paciente, incubamos a placa. A incubação é o tempo necessário e natural para que ocorra a ligação desse antígeno com o anticorpo. Depois, fazemos a lavagem dessa placa pra retirar tudo aquilo que não se ligou ao anticorpo. Agora adicionamos um anticorpo conjugado: Anticorpo Conjugado é aquele que já vem acoplado a uma enzima, essa enzima na maioria dos casos é da classe das peroxidases. Esse anticorpo conjugado é extremamente específico. Sempre que adicionamos um anticorpo precisamos repetir as etapas de incubação e lavagem pra garantir um processo mais ''limpo'' e adequado. O próximo passo é adicionar um substrato específico pra essa enzima. Quando o substrato encontra essa enzima (que está acoplada ao anticorpo conjugado), juntos, irão gerar uma reação que possibilitará a a mudança de cor naquele poço. É importante lembrar que é preciso adicionar uma substância de parada: essa substância impede que a reação da enzima seja constante. Sem ela, a reação constante da enzima iria fazer com que a amostra ficasse cada vez mais escura invalidando o exame.

Explicando o resultado: Quando ocorre a alteração de cor no ELISA direto, essa amostra é POSITIVA. Por que? Pense: colocamos um anticorpo específico pra detectar um determinado antígeno. Mas esse anticorpo que colocamos tem uma enzima acoplada a ele. Quando adicionamos o substrato e notamos a mudança de cor, significa que a enzima reagiu ao substrato, mas essa reação só foi possível pois ela estava acoplada a um anticorpo que detectou seu antígeno. Se o paciente não tivesse aquele antígeno, o anticorpo com essa enzima não haveria reagido ao substrato, logo, não ocorreria mudança de cor, e aí diríamos que é uma amostra NEGATIVA.

ELISA INDIRETO

Ao contrário do ELISA direto, para o ELISA INDIRETO teremos no fundo das nossas placas o antígeno para a patologia que queremos identificar. Adicionamos a amostra do paciente e, se ele tiver a doença ele terá anticorpos obviamente, e esses anticorpos se ligarão aos antígenos presentes na placa. Fazemos a incubação e depois lavagem dessa placa, da mesma maneira como explicado no ELISA direto. Agora adicionamos o anticorpo conjugado - esse anticorpo conjugado é diferente do anticorpo conjugado usado no ELISA direto, pois ele não é específico pro antígeno, ele é específico para anticorpos, e por isso até o chamam de anticorpo anti-anticorpo. Novamente incubamos e lavamos a placa para adicionar o substrato (não esqueçam da substância de parada) e visualizaremos a mudança ou não de cor. No ELISA INDIRETO localizamos se o paciente possui o anticorpo, não o antígeno, se atentem a isso.

ELISA DE CAPTURA 

Assim como no ELISA direto, a placa do ELISA de captura já vem com anticorpos no fundo da nossa microplaca. O fundamento deste teste é, também, identificar os anticorpos específicos (que estão sendo produzidos em decorrência da patologia). Então adicionamos nossa amostra, e se houver a presença dos anticorpos eles vão se ligar com os anticorpos presentes na placa. Fazemos a lavagem para retira aquilo que não se ligou, em seguida, adicionamos o antígeno biotinilado. Mas o que é o antígeno biotinilado? Ele é um antigêno que também é marcado (assim como o anticorpo conjugado), por uma proteína chamada de biotina. Esse antígeno tem a capacidade de se ligar apenas ao nosso anticorpo da patologia em questão. Após a segunda lavagem já retiramos aqueles antígenos que não se ligaram, então podemos adicionar enzimas livres: tem afinidade com a biotina, ocorrendo a ligação, que, na presença do substrato emitirá uma cor. Lembrando que é necessário também a substância de parada nesse tipo de ELISA. Se esse paciente não tivesse os anticorpos específicos para nossa patologia (ou só ligação não específica) o antigeno não biotinilado não se ligaria, e aí nossa enzima também não se ligaria e provavelmente seria retirada com a lavagem, logo não teria alteração de cor. 

ELISA DE COMPETIÇÃO 

Teste pra confirmar que o paciente realmente não é positivo. Nessa situação colocamos a amostra do paciente em uma placa com anticorpos. Se esse paciente tiver antígenos que tenham afinidade com anticorpos do fundo da placa eles irão se ligar. Após o processo de incubação e lavagem adicionamos o antígeno biotinilado. Só que no elisa de competição sua função é diferente: ele vai competir pelo sítio de ligação do anticorpo que está no fundo da placa. Mas ele só vai tomar o lugar do que já está ligado se o que já está ligado não for específico. Se não for específico, o antígeno biotinilado toma lugar. A leitura é contrária pois a gente so vai visualizar a alteração de cor se o antígeno biotinilado se ligar. Se ele se ligou significa que o antigeno da amostra do paciente não é específico então pela alteração de cor dizemos que ele é negativo - por que se fosse positivo não haveria alteração de cor (o biotinilado não conseguiria tomar o lugar). Adicionamos as enzimas que se ligam a biotina, posteriormente o substrato e altera-se a cor: paciente negativo.

REFERÊNCIA:

- Thermo Fisher Scientific;

- Abul K. Abbas: Imunologia Básica 4°edição;